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考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度的原理

更新時間:2025-10-23點(diǎn)擊次數(shù):393

考馬斯藍(lán)染色法(coomassie blue staining)又稱Bradford法,是 Bradford 于 1976 年建立起來的一種蛋白質(zhì)濃度的測定方法。蛋白質(zhì)濃度測定的方法有很多,考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)是實驗室最常見的一種方式,它利用比色法和色素法混合方法、操作簡便。
考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度的原理
考馬斯亮藍(lán)(Coomassie Brilliant Blue)法測定蛋白質(zhì)濃度,是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理,定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn),因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。
考馬斯亮蘭G-250染料,在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合,使染料的最大吸收峰(lmax)的位置,由465nm變?yōu)?595nm,溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn),染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。
考馬斯亮藍(lán)染色法法注意事項
1.在試劑加入后的5-20min內(nèi)測定光吸收,因為在這段時間內(nèi)顏色是更穩(wěn)定的。
2.測定中,蛋白-染料復(fù)合物會有少部分吸附于比色杯壁上,測定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。
3.利用考馬斯亮藍(lán)法分析蛋白必須要掌握好分光光度計的正確使用,重復(fù)測定吸光度時,比色杯一定要沖洗干凈,制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的時候,蛋白標(biāo)準(zhǔn)品最好是從低濃度到高濃度測定,防止誤差。

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