穩(wěn)定同位素標(biāo)記物是研究代謝的有力工具，越來越多地用于體內(nèi)代謝研究，穩(wěn)定同位素標(biāo)記物在體內(nèi)代謝研究中已經(jīng)解決了許多生物學(xué)問題，如：代謝路徑的確認(rèn)、疾病機(jī)理的探索、新調(diào)控原理的發(fā)現(xiàn)、新治療靶點(diǎn)及生物標(biāo)志物的確認(rèn)、新診斷方法的實(shí)施及個(gè)性化治等^[1]。

小分子穩(wěn)定同位素標(biāo)記物是指利用穩(wěn)定同位素（如 2H、13C等）替代化合物中原有的常見同位素（如 1H、12C），從而被標(biāo)記的、相對(duì)分子質(zhì)量較小的有機(jī)或無機(jī)化合物。這種同位素標(biāo)記物核心特點(diǎn)是化學(xué)性質(zhì)與未標(biāo)記的物質(zhì)幾乎保持一致和因質(zhì)量不同導(dǎo)致的物理性質(zhì)的差異，具有無放射性安全環(huán)保和可被質(zhì)譜等儀器檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì)。

原理與用途

其基本原理基于以下兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：

化學(xué)性質(zhì)一致性原理

由于穩(wěn)定同位素（如 13C 和 12C）的電子層結(jié)構(gòu)相同，因此由它們構(gòu)成的標(biāo)記物與其未標(biāo)記的對(duì)應(yīng)物具有幾乎相同的化學(xué)和生物化學(xué)行為。這意味著它們?cè)谏V分離中的保留時(shí)間、在生化反應(yīng)中的酶促反應(yīng)速率、與受體的結(jié)合能力等都是相同的。

質(zhì)量差異的可檢測(cè)性

雖然化學(xué)性質(zhì)相同，但含有重同位素的分子比未標(biāo)記的分子質(zhì)量更大。

這種質(zhì)量差異雖然很小，但可以被高精度的質(zhì)譜儀精確地區(qū)分和檢測(cè)。質(zhì)譜儀能夠根據(jù)質(zhì)荷比（m/z）將“輕"標(biāo)分子和“重"標(biāo)分子分離開，并分別對(duì)它們的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行定量。

圖1  13C-谷氨酰胺納入三氯胺酸循環(huán)^[2]

1. 代謝流分析

這是常用的應(yīng)用之一。通過給細(xì)胞、組織或生物體喂食特定位置被標(biāo)記的底物（例如，13C-葡萄糖），可以追蹤標(biāo)記原子在代謝網(wǎng)絡(luò)（如糖酵解、三羧酸循環(huán)）中的流動(dòng)路徑和速率?？梢杂糜谘芯看x途徑的活躍程度、發(fā)現(xiàn)新的代謝通路、在疾?。ㄈ绨┌Y）中代謝重編程的機(jī)制等。

2. 絕-對(duì)定量分析

在質(zhì)譜-based的定量分析中，將已知量的穩(wěn)定同位素標(biāo)記（作為內(nèi)標(biāo)）加入到含有未知量目標(biāo)分析物的樣品中。由于穩(wěn)定同位素標(biāo)記和分析物在樣品前處理（如萃取、衍生化）和色譜分離過程中的行為一致，但能被質(zhì)譜區(qū)分，因此可以通過穩(wěn)定同位素標(biāo)記的回收率來精確校正分析物的損失。最終，通過比較兩者的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度，即可精確計(jì)算出分析物的絕-對(duì)量。

3. 藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究

在藥物開發(fā)中，使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的藥物分子來研究ADME過程，藥物被身體吸收的程度、藥物在體內(nèi)的分布情況、藥物被代謝成哪些產(chǎn)物和藥物及其代謝物被排出的速度和途徑。使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記可以清晰地將給藥后的藥物分子與內(nèi)源性物質(zhì)或代謝產(chǎn)物區(qū)分開來，并進(jìn)行精確定量。

4. 作為內(nèi)標(biāo)

即使在非定量的篩查中，穩(wěn)定同位素標(biāo)記也常被用作保留時(shí)間內(nèi)標(biāo)或過程監(jiān)控內(nèi)標(biāo)，以校正儀器響應(yīng)的漂移和樣品制備過程中的變異，提高數(shù)據(jù)的可靠性和重復(fù)性。

穩(wěn)定同位素標(biāo)記物——優(yōu)秀示蹤劑

常用的示蹤劑有穩(wěn)定和放射兩種同位素示蹤劑，穩(wěn)定同位素示蹤劑因其標(biāo)記方式靈活多樣、示蹤時(shí)長(zhǎng)不受半衰期限制、給藥方式多樣及示蹤通路研究較多等而受到體內(nèi)代謝研究實(shí)驗(yàn)的追捧。

穩(wěn)定同位素示蹤劑應(yīng)用較多的為含氘 (²H)、碳-13 (¹³C)、碳-15 (¹⁵N)、氧-18 (¹⁸O) 等的同位素標(biāo)記物，全標(biāo)記的示蹤劑具有作為全局示蹤劑的潛力目前廣泛用于代謝研究中，它們可以一次將標(biāo)記轉(zhuǎn)移到多個(gè)下游途徑中，研究多個(gè)通量，如全 ¹³C 標(biāo)記的葡萄糖 (D-Glucose-¹³C6) 和谷氨酰胺 (L-Glutamine-¹³C5) 等，通過給藥體內(nèi)，可分析下游代謝產(chǎn)物，找出上下游代謝途徑及其它們的內(nèi)在關(guān)系、代謝產(chǎn)物的組成和含量等，甚至研究細(xì)胞代謝的動(dòng)態(tài)變化。

圖2  通過¹³C標(biāo)記確認(rèn)OxPPP 和 Non-OxPPP 代謝途徑^[3]

而特定位置標(biāo)記的穩(wěn)定同位素示蹤劑因其在特定位置的同位素原子會(huì)轉(zhuǎn)移到特定的代謝物中，對(duì)研究特定通路方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，目前也被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)代謝研究匯中，如有 [1-¹³C]-glucose 和 [1，2-¹³C]-glucose 在研究葡萄糖是參與的有氧化磷酸戊糖 (OxPPP) 還是非氧化磷酸戊糖 (Non-OxPPP) 途徑中發(fā)揮了重大作用[3]。

如何選擇合適穩(wěn)定同位素示蹤劑——體內(nèi)代謝

1、選定標(biāo)記策略

測(cè)通量/速率 → 單一位置標(biāo)記

例：測(cè)糖酵解通量，用 13C-1-葡萄糖。

探索未知途徑/全局視圖 → 均勻標(biāo)記

例：探索葡萄糖的全面命運(yùn)，用 13C6-葡萄糖。

區(qū)分相似分支途徑 → 位置特異性標(biāo)記

例：TCA循環(huán)與回補(bǔ)反應(yīng)，用 13C-1,2-葡萄糖。

2、選定標(biāo)記原子

碳代謝（糖、脂、氨基酸） → 13C

脂質(zhì)合成/氧化還原 → 2H

蛋白質(zhì)/氨基酸代謝 → 1?N

能量代謝/ATP合成 → 1?O

3、選定合適給藥方式

口服：方便，模擬天然攝食。但需考慮首過效應(yīng)和腸道微生物的干擾。

靜脈注射：可快速達(dá)到穩(wěn)定血藥濃度，提供清晰的動(dòng)力學(xué)起點(diǎn)。

腹腔注射：折中方案，吸收較快且操作相對(duì)簡(jiǎn)單。

輸注：用于穩(wěn)態(tài)代謝流分析，通過持續(xù)輸注使體內(nèi)示蹤劑達(dá)到“同位素穩(wěn)態(tài)"。

4、上機(jī)檢測(cè)

僅能測(cè)標(biāo)記/未標(biāo)記 → 低分辨率質(zhì)譜 → 選擇簡(jiǎn)單標(biāo)記。

能測(cè)同位素標(biāo)記模式 → 高分辨率質(zhì)譜 → 可選擇均勻或位置特異性標(biāo)記。

小提示

標(biāo)記物性質(zhì)：要求穩(wěn)定（在體內(nèi)不分解、不交換）與惰性（不干擾正常代謝）。

代謝路徑：要求清晰可控，需預(yù)先明確其代謝途徑與產(chǎn)物，確保數(shù)據(jù)可解讀。

實(shí)驗(yàn)操作：方案需具體可行，包括遞送方法、劑量、樣品處理與數(shù)據(jù)分析方法。

經(jīng)濟(jì)成本：預(yù)算需提前規(guī)劃，因標(biāo)記物價(jià)格昂貴，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)規(guī)模權(quán)衡策略與總量。

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