Westernblot法即是一種將電泳與KIJSA結(jié)合起來的技術(shù)，可分為電泳、轉(zhuǎn)印、酶免疫測定3個(gè)階段。Westernblot法結(jié)合了電泳的高分辨率和酶免疫測定的高敏感性和特異性，是一種能用于分析樣本組分的免疫學(xué)測定方法。

western blot的作用

與Southern Blot或Northern Blot雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。

Westernblot的應(yīng)用

Westernblot法應(yīng)用分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中時(shí)常會用到的一種實(shí)驗(yàn)方法，并且是一種能對蛋白進(jìn)行定性和半定量的分析方法。是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，并且通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。

蛋白質(zhì)分析中應(yīng)用的W estern雜交法與DNA分析應(yīng)用的Southern雜交法相似，均是把電流分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移一種固相支持體，并均以針對特定氨基酸(Westernblot法)或核苷酸(Southern雜交法)序列所制備的特異性樣品作為探針檢測其相同或相似序列。

對于蛋白質(zhì)來說，通常使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。Westernblot法的主要優(yōu)點(diǎn)在于，它能夠從生物組織的粗提物或部分純化的粗提物中檢測和識別幾種特異的蛋白質(zhì)。將聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)分離的蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠上通過電轉(zhuǎn)移到一張合適的印跡膜上，隨后用和靈敏檢測系統(tǒng)相偶聯(lián)的抗體來識別結(jié)合在膜上的一種或幾種蛋白質(zhì)。這一技術(shù)的靈敏度能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的固相放射免疫分析的水平而又無需像免疫沉淀法那樣必須對靶蛋白進(jìn)行放射性標(biāo)記。因此要對非放射性標(biāo)記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特定蛋白進(jìn)行鑒別和定量時(shí)，Westernblot法極為有用。此外，由于蛋白質(zhì)的電泳分離幾乎總在變性條件下進(jìn)行，因此溶解、聚集以及靶蛋白與外來蛋白的共沉淀等諸多問題全都無需加以考慮。