非蛋白質(zhì)巰基含量檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC1435
規(guī)格：100T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液的配制：將提取液一和提取液二按體積比1：1的比例混合配制，按照樣本數(shù)量配制并在當(dāng)天用完；

2. 試劑二：臨用前加入2 mL無水甲醇充分溶解備用，4℃可保存八周；

3. 標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg半胱*酸，臨用前加入1.65 mL提取液配制成50 µmol/mL的半胱*酸標(biāo)準(zhǔn)溶液備用，2-8℃可保存1個月。

產(chǎn)品說明：
生物體內(nèi)巰基主要包括非蛋白質(zhì)巰基和蛋白質(zhì)巰基。巰基化合物在體內(nèi)具有重要的解毒功能，對生物體的自我調(diào)節(jié)具有非常重要的生理意義。

巰基基團(tuán)與5,5’-二硫代-雙-硝*酸（DTNB）反應(yīng)，生成黃色化合物，在412nm處有最大吸收峰。

技術(shù)指標(biāo)：
低檢出限：0.0061 μmol/mL
線性范圍：0.00625-0.8 μmol/mL
注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、恒溫水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、甲醇、研缽/勻漿器、超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 動物、植物組織：稱取約0.1g，加入1mL的提取液，制備成10%的勻漿，10000g，常溫離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細(xì)胞或細(xì)菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)胞（功率200w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min），然后10000g，常溫離心10min，取上清置冰上待測。

3. 血清（漿）、培養(yǎng)液等液體樣本：向0.1mL血清（漿）、培養(yǎng)液等液體樣本中加入1mL提取液，10000g，常溫離心10min，取上清置冰上待測。

二、測定步驟

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品的制備：將50μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液用提取液稀釋至0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液待測，現(xiàn)用現(xiàn)配，具體稀釋可參考下表。

備注：實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需60µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1. 操作表

三、計算公式

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）帶入公式計算樣本濃度（x，μmol/mL）。

1. 非蛋白質(zhì)巰基含量計算：

1. 按樣本質(zhì)量計算

非蛋白質(zhì)巰基含量（µmol/g 質(zhì)量）=x×V提取÷W=x÷W

1. 按血清、培養(yǎng)液體積計算

非蛋白質(zhì)巰基含量（µmol/mL）=x×（V提取+V液體）÷V液體=11×x

1. 按細(xì)胞數(shù)量計算

非蛋白質(zhì)巰基含量（μmol/10⁴ cell）=x×V提取÷500=0.002×x
V提取：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr，樣本蛋白濃度，mg/mL；500：500萬個細(xì)胞；V液體：血清（漿）或培養(yǎng)液體積，0.1mL。

注意事項：
如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進(jìn)行測定。注意同步修改計算公式。
實驗實例：

1. 取0.1g小鼠腎臟加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定-A對照=0.457-0.061=0.396，帶入標(biāo)曲y=2.4988x+0.0666，得出x=0.1318，按樣本質(zhì)量計算含量得：

非蛋白質(zhì)巰基含量（µmol/g質(zhì)量）=x÷W=0.1318÷0.1=1.318µmol/g 質(zhì)量。
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