線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ/細(xì)*色素C氧化酶活性檢測(cè)試劑盒說明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號(hào)：BC0945
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：試劑放于試劑瓶?jī)?nèi)玻璃瓶中。臨用前取1支加入13.5mL試劑一溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融；

2. 試劑三：試劑置于試劑瓶?jī)?nèi)EP管中；臨用前取1支加入2mL試劑一溶解，用不完的試劑-20℃保存2周，避免反復(fù)凍融；

3. 工作液的配制：臨用前取0.5mL試劑三加入到溶解好的4.5mL試劑二中混合備用（約25T），或者按比例現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：
線粒體復(fù)合體Ⅳ又稱細(xì)*色素C氧化酶，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負(fù)責(zé)催化還原型細(xì)*色素C的氧化，并最終把電子傳遞給氧生成水。還原型細(xì)*色素C在550nm有特征光吸收，線粒體復(fù)合體Ⅳ催化還原型細(xì)*色素C生成氧化型細(xì)*色素C，因此550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅳ酶活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件
注意事項(xiàng)：

1. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果測(cè)定的吸光值過高（高于1），可用蒸餾水稀釋上清液后再測(cè)定。計(jì)算結(jié)果時(shí)注意乘以稀釋倍數(shù)。若ΔA大于0.4，需將樣本稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），使A1-A2小于0.2，可提高檢測(cè)靈敏度；若ΔA偏小，則可以通過增加加入的樣本體積來提高靈敏度。

2. 由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測(cè)定樣本蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量（單獨(dú)測(cè)量）。

3. 本試劑盒試劑足夠完成50管反應(yīng)

4. 附：使用樣本重量計(jì)算公式：（檢測(cè)樣本數(shù)為100T/48S）

A、上清中復(fù)合體Ⅳ活力的計(jì)算：
單位定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)*色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(U/g 質(zhì)量)=[ΔA上清×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=1099×ΔA上清÷W
ΔA上清：上清測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，2.1×10^-4L；ε：細(xì)*色素C摩爾消光系數(shù)，1.91×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V提取：加入提取液體積，1.0mL；W：樣本重量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
B、沉淀中復(fù)合體Ⅳ活力的計(jì)算：
單位定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)*色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(U/g 質(zhì)量)=[ΔA沉淀×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=440×ΔA沉淀÷W
ΔA沉淀：沉淀測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，2.1×10^-4L；ε：細(xì)*色素C摩爾消光系數(shù)，1.91×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V提?。杭尤胩崛∫后w積，0.4mL。W：樣本重量，g。T：反應(yīng)時(shí)間，1min；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
C、樣本復(fù)合體Ⅳ總活力的計(jì)算：
樣本復(fù)合體Ⅳ總活力即為上清中復(fù)合體Ⅳ活力與沉淀中復(fù)合體Ⅳ活力之和。
按樣本質(zhì)量計(jì)算：復(fù)合體Ⅳ（U/g 質(zhì)量）=1099×ΔA上清÷W+440×ΔA沉淀÷W
D、按96孔板計(jì)算：
將上述計(jì)算公式中的d-1cm改為d-0.6cm進(jìn)行計(jì)算即可。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g兔肝臟進(jìn)行樣本處理，按照測(cè)定步驟操作，用微量玻璃比色皿ΔA2=A1空白管-A2空白管=0.7713-0.7669=0.0044，上清液的ΔA1=A1測(cè)定管-A2測(cè)定管=0.7985-0.7754=0.0231，ΔA上清=ΔA1-ΔA2=0.0231-0.0044=0.0187，沉淀中的ΔA1=A1測(cè)定管-A2測(cè)定管=0.8843-0.7415=0.1428，ΔA沉淀=ΔA1-ΔA2=0.1428-0..0044=0.1384，按樣本質(zhì)量計(jì)算：

上清液中復(fù)合體Ⅳ活力(U/g 質(zhì)量)=1099×ΔA上清÷W=1099×0.0187÷0.1=205.513 U/g 質(zhì)量
沉淀中復(fù)合體Ⅳ活力(U/g 質(zhì)量)=440×ΔA沉淀÷W=440×0.1384÷0.1 =608.96 U/g 質(zhì)量
則樣本復(fù)合體Ⅳ總活力（U/g 質(zhì)量）=1099×ΔA上清÷W+440×ΔA沉淀÷W
=1099×0.0187÷0.1+440×0.1384÷0.1=814.473 U/g 質(zhì)量。
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

1. Qiuli OuYang,Nengguo Tao,Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. Frontier in Immunology. February 2018;(IF4.259)

2. Huazhang Zhu,Weizhen Zhang,Yingying Zhao,et al. GSK3β-mediated tau hyperphosphorylation triggers diabetic retinal neurodegeneration by disrupting synaptic and mitochondrial functions. Molecular Neurodegeneration. November 2018;(IF8.274)

3. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2019, 134: 229-238.

1. Bao Z, Xu X, Chao H, et al. ERK/Nrf2/HO-1 pathway-mediated mitophagy alleviates traumatic brain injury-induced intestinal mucosa damage and epithelial barrier dysfunction[J]. 2017.

2. Li N, Qin S, Xie L, et al. Elevated Serum Potassium Concentration Alleviates Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury via Mitochondrial Preservation[J]. Cellular Physiology and Biochemistry, 2018, 48(4): 1664-1674.

參考文獻(xiàn)：

1. Willis J H, Capaldi R A, Huigsloot M, et al. Isolated deficiencies of OXPHOS complexes I and IV are identified accurately and quickly by simple enzyme activity immunocapture assays[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2009, 1787(5): 533-538.

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BC0510/BC0515 線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ活性檢測(cè)試劑盒
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