乙醛脫氫酶（ALDH）活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號：BC0755
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前取一支試劑二加入1.5mL蒸餾水溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

2. 試劑四：為有毒試劑，實(shí)驗(yàn)室注意防護(hù)；

3. 工作液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑一：試劑二：試劑三：試劑四=60µL：20µL：4µL：6µL（1T）的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：
乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）是醛脫氫酶的一種，能夠催化乙醛、正 丁醛、肉桂醛、苯甲醛等有毒醛類快速脫氫，催化醛類物質(zhì)氧化生成羧酸，清除有害醛類并減少脂類的過氧化反應(yīng)，被認(rèn)為是生物體內(nèi)活性氧物質(zhì)的解毒劑。乙醛脫氫酶不僅能夠轉(zhuǎn)化代謝對生物體有害的醛類，還在分子生物學(xué)以及相關(guān)疾病的檢測方面有較廣泛的研究應(yīng)用。

乙醛脫氫酶催化乙醛和NAD⁺轉(zhuǎn)化為乙酸和NADH，利用NADH在340nm處吸光值的變化即可計算得到乙醛脫氫酶的活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、分析天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例加入提取液（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，于4℃，10000g離心20min，取上清置于冰上待測。

2. 細(xì)胞/細(xì)菌樣本：按照細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例加入提取液（建議500萬細(xì)胞/細(xì)菌加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃，10000g離心20min，取上清置于冰上待測。

3. 血清（漿）等液體：直接檢測。若液體有渾濁則離心后進(jìn)行測定。

二、測定步驟

1. 紫外分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，紫外分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2. 工作液37℃預(yù)熱10min。

3. 操作表：

三、ALDH酶活計算
A 按微量石英比色皿計算：

1. 按蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個酶活單位。
ALDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=26.795×ΔA÷Cpr

1. 按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每克樣本每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個酶活單位。
ALDH酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T=26.795×ΔA÷W

1. 按細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量計算

酶活定義：每10⁶個細(xì)胞/細(xì)菌每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個酶活單位。
ALDH酶活（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣÷V樣總×N）÷T=26.795×ΔA÷N

1. 按液體體積計算

酶活定義：每mL樣本每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個酶活單位。
ALDH酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷V樣÷T=26.795×ΔA
ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本上清體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，需自行測定；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞/細(xì)菌總數(shù)，以10⁶計；T：反應(yīng)時間，30min；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
B 按96孔UV板計算：



將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔UV板光徑）進(jìn)行計算即可。
注意事項(xiàng)：

1. 空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔，正常情況下，其OD值不超過0.3（比色皿）0.2（96孔板），變化不超過0.01。

2. 樣品ΔA大于1時，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測定。當(dāng)ΔA小于0.01時，可以延長反應(yīng)時間（60min或更長時間）來測定。計算時注意同步更改計算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1084g兔肝臟，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿研磨，離心取上清，之后按照測定步驟操作，用96孔UV板測得計算ΔA測定=A2測定-A1測=0.878-0.838=0.040，ΔA空白=A2空白-A1空白=0，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.040-0=0.040，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

ALDH酶活（U/g質(zhì)量）=0.040÷（6.22×10³×0.6）×10⁹×2×10^-4÷（0.04×0.1023÷1）÷30=16.479 U/g質(zhì)量。

1. 取0.1100g小鼠肝臟，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿研磨，離心取上清，之后按照測定步驟操作，用96孔UV板測得計算ΔA測定=A2測定-A1測=1.624-0.798=0.826，ΔA空白=A2空白-A1空白=0，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.826-0=0.826，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

ALDH酶活（U/g質(zhì)量）=0.826÷（6.22×10³×0.6）×10⁹×2×10^-4÷（0.04×0.1023÷1）÷30=335.343 U/g質(zhì)量。
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：
[1] Tongmeng Jiang,Jinmin Zhao,Shan Yu,et al. Untangling the response of bone tumor cells and bone forming cells to matrix stiffness and adhesion ligand density by means of hydrogels. Biomaterials. January 2019;188:130-143.(IF5.452)
[2] Chong Li, Shi Gao, Xiaotong Li,et al. Efficient metabolic evolution of engineered Yarrowia lipolytica for succinic acid production using a glucose-based medium in an in situ fibrous bioreactor under low-pH condition. Biotechnology for Biofuels. August 2018;(IF5.452)
[3] Yufei He,Xiaoyan Ci,Ying Xi,et al. Untangling the response of bone tumor cells and bone forming cells to matrix stiffness and adhesion ligand density by means of hydrogels. Biomaterials. September 2018;(2019)188:130-143.(IF8.806)
相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC0590/BC0595 游離脂肪酸（FFA）含量檢測試劑盒
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BC1080/BC1085 乙醇脫氫酶（ADH）活性檢測試劑

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