外切β-1,4-葡聚糖酶/纖維二糖水解酶（C1）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC4305

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前取1瓶加入3 mL蒸餾水溶解備用，現(xiàn)用現(xiàn)配；2-8℃保存4周；

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：5 μmol/mL 對(duì)硝基 苯* 溶液。

產(chǎn)品說(shuō)明：

β-1,4-葡聚糖酶/纖維二糖水解酶（C1，EC3.2.1.91）存在于細(xì)菌、真菌和動(dòng)物體內(nèi)，是微生物纖維素降解酶系的主要組分，也是水解天然纖維素的必需組分，C1酶作用于纖維素線(xiàn)狀分子的末端，水解β-葡萄糖苷鍵，每次切下1個(gè)纖維二糖分子。

C1能夠催化對(duì)*纖維二糖苷 (PNPC)生成對(duì)硝 基 苯*，后者在400 nm有特征光吸收。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、天平、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、EP管。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）: 提取液體積(mL)為1 : 5~10 的比例（建議稱(chēng)取0.1 g 組織，加入1 mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。10000g，4℃離心10 min，取上清置冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)菌或真菌數(shù)量10⁴個(gè) : 提取液體積（mL）500~1000 : 1 的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或真菌加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率200W，超聲3 s，間隔7s，總時(shí)間3min）然后10000g，4℃，離心10 min，取上清置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）等液體：直接測(cè)定。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至400 nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋?zhuān)喝?/span>50μL 5 μmol/mL對(duì)硝 基 苯* 溶液，加入750μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.3125 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。（實(shí)驗(yàn)中每管需要20μL，為減小實(shí)驗(yàn)誤差，故配制大體積。）

3、 操作表（在1.5 mL離心管中依次加入下列試劑）：

    渦旋混勻后室溫放置2 min，吸取200 μL于微量玻璃比色皿或96孔板中測(cè)定400 nm下的的吸光度，分別記為A測(cè)定管、A對(duì)照管、A標(biāo)準(zhǔn)管、A空白管。計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定管-A對(duì)照管，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需測(cè)1-2次。

三、C1酶活計(jì)算

1、按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每mg蛋白在反應(yīng)體系中每小時(shí)生成1 nmol對(duì)硝 基 苯*定義為一個(gè)酶活力單位。

C1 (U/mg prot) =ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)）×1000×V樣÷（Cpr×V樣）÷T=312.5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每g樣本在反應(yīng)體系中每小時(shí)生成1 nmol對(duì)硝 基 苯*定義為一個(gè)酶活力單位。

C1 (U/g 質(zhì)量)= ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)）×1000×V樣÷(V樣÷V樣總×W)÷T=312.5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

3、按照細(xì)菌或真菌數(shù)量計(jì)算

酶活定義：每10⁴個(gè)細(xì)菌或真菌在反應(yīng)體系中每小時(shí)生成1 nmol對(duì)硝 基 苯*定義為一個(gè)酶活力單位。

C1 (U/10⁴ cell)= ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)）×1000×V樣÷（細(xì)菌或真菌數(shù)量×V 樣÷V樣總）÷T

=312.5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷細(xì)菌或真菌數(shù)量

 4、按液體體積計(jì)算

酶活定義：每毫升液體在反應(yīng)體系中每小時(shí)催化生成1 nmol對(duì) 硝基 苯*為一個(gè)酶活力單位。

C1 (U/mL)= ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)）×1000×V樣÷V樣÷T=312.5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)

C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度：0.3125 μmol/mL；V樣：加入的樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入的提取液體積，1 mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 h；細(xì)菌或真菌數(shù)量：以萬(wàn)計(jì)；W：樣本質(zhì)量，g；1000：換算系數(shù)，1 μmol=1000 nmol。

注意事項(xiàng)：

1、若吸光度大于1.5時(shí)，建議將樣本用提取液稀釋后進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算公式乘以稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g香菇進(jìn)行樣本處理，離心取上清稀釋2倍后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定管-A對(duì)照管=1.454-0.047=1.407，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.292-0.047=0.245，根據(jù)樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

C1（U/g 質(zhì)量）=312.5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×2（稀釋倍數(shù)）=312.5×1.407÷0.245÷0.1×2=35893 U/g 質(zhì)量。

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