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專注于生物學(xué)試劑及試劑盒領(lǐng)域
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產(chǎn)品中心生化檢測(cè)試劑盒-常量法抗氧系列BC4340-50T/24S亞鐵氧化酶（HP）活性檢測(cè)試劑盒 抗氧化
產(chǎn)品型號(hào)：BC4340-50T/24S
更新時(shí)間：2024-04-16
廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家
訪 問(wèn) 量 ：1183
010-50973130
產(chǎn)品分類
亞鐵氧化酶（HP）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
可見(jiàn)分光光度法
貨號(hào)：BC4340
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
試劑一 | 液體20 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體3 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、試劑三：臨用前加入7 mL蒸餾水溶解備用，用不完的試劑2-8℃保存4周。
2、標(biāo)準(zhǔn)品：9 µmol/mL的亞鐵離子標(biāo)準(zhǔn)液。
產(chǎn)品說(shuō)明：
亞鐵氧化酶（Hsphasetin，HP）是銅藍(lán)蛋白的同系物，催化亞鐵離子（Fe2+）氧化為三價(jià)鐵離子（Fe3+），從而三價(jià)鐵與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞鐵釋放。
以一定濃度的Fe2+ 為底物，在亞鐵氧化酶的催化作用下Fe2+ 被氧化為Fe3+，Fe2+ 與菲咯嗪形成有色復(fù)合物，在562 nm處有特征吸收峰，先計(jì)算出未被氧化的Fe2+ 的含量，進(jìn)而得出被氧化的Fe2+ 的含量，可通過(guò)Fe2+ 被氧化的速率來(lái)反映亞鐵氧化酶活性。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、1 mL玻璃比色皿、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1、組織：按照質(zhì)量（g）︰蒸餾水體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g，加入1 mL蒸餾水）加入蒸餾水，冰浴勻漿后于10000 rpm，4℃離心10 min，取上清置于冰上待測(cè)。
2、血清或血漿：建議用蒸餾水將血清或血漿稀釋2~4倍后直接檢測(cè)。若溶液渾濁則離心取上清置于冰上待測(cè)。
二、測(cè)定步驟
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至562 nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：將9 µmol/mL的亞鐵離子標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水倍比稀釋為360、180、90、45、22.5、11.25、5.625 nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。
3、 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋可參考下表：
序號(hào) | 稀釋前濃度（nmol/mL） | 標(biāo)準(zhǔn)液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度（nmol/mL） |
1 | 9000 | 40 | 960 | 360 |
2 | 360 | 500 | 500 | 180 |
3 | 180 | 500 | 500 | 90 |
4 | 90 | 500 | 500 | 45 |
5 | 45 | 500 | 500 | 22.5 |
6 | 22.5 | 500 | 500 | 11.25 |
7 | 11.25 | 500 | 500 | 5.625 |
備注：實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需100µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。
4、 操作表：在1.5 mL離心管中依次加入下列試劑：
試劑名稱 | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 | 無(wú)基質(zhì)管 | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 |
蒸餾水（µL） | - | - | 20 | 20 | 20 |
樣本（µL） | 20 | 20 | - | - | - |
試劑一（µL） | 280 | 280 | 280 | 280 | 280 |
用移液槍充分吹打混勻 | |||||
試劑二（µL） | - | 100 | 100 | - | - |
標(biāo)準(zhǔn)溶液（µL） | - | - | - | - | 100 |
蒸餾水（µL） | 100 | - | - | 100 | - |
混勻，37℃水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱中準(zhǔn)確反應(yīng)3 min | |||||
試劑三 （µL） | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
蒸餾水（µL） | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 |
混勻，于1 mL玻璃比色皿測(cè)定562 nm處吸光值A，分別記為A對(duì)照管、A測(cè)定管、A無(wú)基質(zhì)、A空白管和A標(biāo)準(zhǔn)管。計(jì)算ΔA測(cè)定=（A無(wú)基質(zhì)管-A空白管）-（A測(cè)定管-A對(duì)照管），ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管，同一批次無(wú)基質(zhì)管、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)1-2次。 | |||||
三、亞鐵氧化酶活性計(jì)算
1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（nmol/mL）為x軸，其對(duì)應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y= kx+b，將ΔA測(cè)定帶入方程得到樣本濃度（x，nmol/mL）。
2、 亞鐵氧化酶活性的計(jì)算：
（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算
酶活定義：每mg蛋白每分鐘氧化1 nmol的Fe2+ 定義為1個(gè)酶活力單位。
亞鐵氧化酶酶活（U/mg prot）= x×V試劑二÷（V樣×Cpr）÷T ×N= 1.667x÷Cpr×N
（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活定義：每g樣品每分鐘氧化1 nmol的Fe2+ 定義為1個(gè)酶活力單位。
亞鐵氧化酶酶活（U/g質(zhì)量）= x×V試劑二÷（V樣×W÷V提?。?/span>÷T×N = 1.667x÷W×N
（3）按液體體積計(jì)算
酶活定義：每mL樣本每分鐘氧化1 nmol的Fe2+ 定義為1個(gè)酶活力單位。
亞鐵氧化酶酶活（U/mL）= x×V試劑二÷V樣÷T ×N= 1.667x×N
V試劑二：加入的試劑二體積，0.1 mL；V樣：加入的樣本體積，0.02 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間：3 min；N：稀釋倍數(shù)。
注意事項(xiàng)：
1、當(dāng)A測(cè)定低于0.1時(shí)，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：
1、 取0.1g脾臟，進(jìn)行樣本處理，按照測(cè)定操作步驟，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=（A無(wú)基質(zhì)管-A空白管）-（A測(cè)定管-A對(duì)照管）=（0.976-0.005）-（0.996-0.047）=0.022，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0027x + 0.0036，計(jì)算x=6.815，按照樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：
亞鐵氧化酶酶活（U/g質(zhì)量）= 1.667×x÷W×N= 1.667×6.815÷0.1=113.603 U/g質(zhì)量。
2、 取兔血清，按照測(cè)定操作步驟，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=（A無(wú)基質(zhì)管-A空白管）-（A測(cè)定管-A對(duì)照管）=（0.976-0.005）-（0.469-0.009）=0.511，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0027x + 0.0036，計(jì)算x=187.926，按照液體體積計(jì)算酶活得：
亞鐵氧化酶酶活（U/mL）= 1.667×x=1.667×187.926=313.273 U/mL。
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