北京索萊寶科技有限公司
專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC2240-50T/48S
更新時間：2024-12-04
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1931
010-50973130
產品分類
果糖-1,6-二磷酸（FDP）含量檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC2240
規(guī)格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
| 試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
| 提取液一 | 液體30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 提取液二 | 液體5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑一 | 液體20 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑二 | 液體×2支 | 2-8℃保存 |
| 試劑三 | 液體15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑四 | 液體40 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 標準品 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
試劑二：臨用前取一支加入0.5 mL蒸餾水，充分溶解后待用，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；
標準品：臨用前加入1176μL 蒸餾水充分溶解，配制成50μmol/mL果糖-1,6-二磷酸標準溶液，2-8℃可以保存4周。
產品說明：
果糖1,6-二磷酸（fructose-1,6-diphosphate, FDP）是糖酵解過程中的一種重要的中間產物，對多種酶具有調節(jié)作用，具有改善細胞能量代謝、增加能量利用、抗心律失常及抗組織過氧化等作用，廣泛應用于臨床醫(yī)藥。
醛縮酶催化果糖1,6-二磷酸裂解，產物與2,4-二* 苯 肼在酸性介質中反應生成2,4-二*苯腙，在堿性溶液中呈紅棕色，在540 nm處有特征吸收峰。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、低溫臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰、蒸餾水和EP管。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
組織：按照質量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
細胞：按照細胞數量（104個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
注：提取液二需緩慢加入，加入后會產生大量氣泡，建議使用2mL EP管進行操作。
二、測定步驟
分光光度計預熱30min 以上，調節(jié)波長至540nm，蒸餾水調零。
將50µmol/mL的果糖-1,6-二磷酸標準液用蒸餾水倍比稀釋為1.5625、0.78125、0.39、0.2、0.1 µmol/mL的標準溶液備用。
標準品稀釋表：
| 序號 | 稀釋前濃度（μmol/mL） | 標準液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度μmol/mL） |
| 1 | 50 | 30 | 930 | 1.5625 |
| 2 | 1.5625 | 200 | 200 | 0.78125 |
| 3 | 0.78125 | 200 | 200 | 0.39 |
| 4 | 0.39 | 200 | 200 | 0.2 |
| 5 | 0.2 | 200 | 200 | 0.1 |
實驗中每個標準管需100µL標準溶液。
樣本測定：(在1.5 mL離心管中操作）
| 試劑名稱（µL） | 對照管 | 測定管 | 空白管 | 標準管 |
| 樣本 | 100 | 100 | - | - |
| 蒸餾水 | - | - | 100 | - |
| 標準溶液 | - | - | - | 100 |
| 試劑一 | 220 | 200 | 220 | 200 |
| 試劑二 | - | 20 | - | 20 |
| 充分混勻，37℃準確反應2 h | ||||
| 試劑三 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| 充分混勻，37℃準確反應20 min | ||||
| 試劑四 | 500 | 500 | 500 | 500 |
| 充分混勻，37℃準確反應10 min | ||||
| 1mL玻璃比色皿中測定540nm處吸光值A，分別記為A對照管、A測定管、A空白管和A標準管。計算ΔA=A測定管-A對照管，ΔA標準=A標準管-A空白管。（空白管和標曲只需檢測1-2次） | ||||
三、FDA含量計算
標準曲線的繪制：
以各個標準溶液的濃度為x軸，其對應的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y= kx+b，將ΔA帶入方程得到x（µmol/mL）。
FDP含量的計算：
（1）按樣本質量計算
FDP含量（µg/g 質量）=x×(V上清+V提取液二)×M÷(W×V上清÷V提取液一)=403.75x÷W
（2）按細胞數量計算
FDP含量（µg/104 cell）=x×(V上清+V提取液二)×M÷(V上清÷V提取液一×N)=403.75x÷N
（3）按液體體積計算
FDP含量（µg/mL）=x×（V上清+V提取液二）×M÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）]=4441.25x
V上清：提取時上清液體積，0.8mL；V提取液二：提取液二的體積，0.15mL；V提取液一：提取液一的體積，1mL；W：樣本質量，g；M：果糖-1,6-二磷酸分子質量，340；V液體：液體樣本體積，0.1mL；N：細胞數量，以萬計。
注意事項：
當ΔA測定大于0.5時，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定，計算公式中乘以稀釋倍數。
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