一氧化氮（NO）含量檢測試劑盒說明書（化學法）

微量法

貨號：BC5485

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前加入6mL蒸餾水，可50℃助溶，2-8 ℃可保存12周。冷卻至常溫使用；

2、 顯色液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照顯色液A液：顯色液B液=50μL: 50μL（100μL，1T）的比例配制顯色液，充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；

3、 標準品：10μmol/mL亞*酸鈉。

4、 0.05μmol/mL標準溶液的配制：取50μL 10μmol/mL亞*酸鈉，加入950μL蒸餾水，配制濃度為0.5 μmol/mL；再取100μL 0.5μmol/mL亞*酸鈉和900μL蒸餾水混勻配制成0.05 μmol/mL的標準溶液備用。

產(chǎn)品說明：

一氧化氮（Nitric Oxide，NO）是一種極不穩(wěn)定的生物自由基，分子小，結(jié)構(gòu)簡單，常溫下為氣體，微溶于水，具有脂溶性，可快速透過生物膜擴散，作為一種新型的生物信使分子，在細胞間及細胞內(nèi)發(fā)揮傳遞信號的作用。其廣泛分布于生物體內(nèi)各組織中，特別是神經(jīng)組織中。在機體神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng)中也起著十分重要的作用。

NO在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成NO₂^-。在酸性條件下，NO₂^-與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物，進一步與萘基乙烯基二胺偶合，產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰，測定其吸光值，可以計算NO含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、分析天平、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織樣本：按質(zhì)量（g）: 提取液體積（mL）2 ~5：10的比例加入提取液（建議稱取0.2g樣本，加入1.0mL提取液），冰浴勻漿后，于4℃，10000g，離心15min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

2. 細菌/細胞樣本：按細菌/細胞數(shù)量（10⁴）：提取液體積（mL）1000~2000 : 1的比例加入提取液（建議1000萬細菌/細胞加入1.0mL提取液），冰浴超聲破碎細菌/細胞（功率200W，超聲3s，間隔7s，總時間5min），然后于4℃，10000g，離心15min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

3. 血清（血漿）等液體樣本：直接測定。若液體有渾濁則離心取上清測定。

二、測定步驟

1．可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至550nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2．在1.5mL EP管按下表順序加樣：

三、NO含量計算

1. 按樣本蛋白濃度計算

NO含量（μmol/mg prot）= ΔA測定×（C標÷ΔA標準）×V樣÷(V樣×Cpr) = 0.05×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計算

NO含量（μmol/g 質(zhì)量）= ΔA測定×（C標÷ΔA標準）×V樣÷(W×V樣÷V樣總) = 0.05×ΔA測定÷ΔA標準÷W

3. 按細菌/細胞數(shù)量計算

NO含量（μmol/10⁴ cell）=ΔA測定×（C標÷ΔA標準）×V樣÷(V樣×N÷V樣總) =0.05 ×ΔA測定÷ΔA標準÷N

4. 按液體體積計算

NO含量（μmol/mL）= ΔA測定×（C標÷ΔA標準）×V樣÷V樣= 0.05×ΔA測定÷ΔA標準

C標：標準管濃度，0.05μmol/mL；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細菌/細胞總數(shù)，以10⁴計。

注意事項：

1、 如果?A測定小于0.005，可以增加樣本量后再進行測定；如果?A測定大于0.7，建議將樣本上清用提取液適當稀釋后再進行測定。注意同步修改計算公式。

2、 如果樣本上清有顏色（在550nm下有吸收峰），則需要補測樣本的對照管，即將顯色液用相同體積的蒸餾水代替。在550 nm下測定吸光值A，分別記為 A標準、A測定、A空白、A對照，計算ΔA標準=A標準-A空白，ΔA測定=A測定-A對照。此時試劑盒規(guī)格為100T/48S。

實驗實例：

1. 取0.203g合歡葉片樣本，加入1mL提取液進行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA測定=A測定-A空白=0.082-0.047=0.035，ΔA標準=A標準-A空白=0.402-0.047=0.355，按樣本質(zhì)量計算得：

NO含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.05×ΔA測定÷ΔA標準÷W = 0.0243 μmol/g 質(zhì)量。

2. 取0.215g小鼠心臟樣本，加入1mL提取液進行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA測定=A測定-A空白=0.102-0.047=0.055，ΔA標準=A標準-A空白=0.402-0.047=0.355，按樣本質(zhì)量計算得：

NO含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.05×ΔA測定÷ΔA標準÷W = 0.0360 μmol/g 質(zhì)量。

3. 取100μL人血清樣本，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA測定=A測定-A空白=0.071-0.047=0.024，ΔA標準=A標準-A空白=0.402-0.047=0.355，按液體體積計算得：

NO含量（μmol/mL）=0.05×ΔA測定÷ΔA標準 = 0.0034μmol/mL。

參考文獻：

[1] Green LC, Wagner DA, Glogowski J. et al. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids[J]. Analytical Biochemistry, 1982, 126(1): 131-138.

[2] Thomsen LL, Ching LM, Baguley BC. Evidence for the production of nitric oxide by activated macrophages treated with the antitumor agents flavone-8-acetic acid and xanthenone-4-acetic acid [J]. Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 1990, 50(21): 6966-6970. 

[3] Yang Wenping, Li Junmin, Wang Jinwen. Comparison of determination methods of serum nitric oxide content[J]. Experimental and Laboratory Medicine, 2002, 20(03): 147-148. 

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