土壤植酸酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。

貨號(hào)：BC5375

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：甲苯，需自備。

2. 試劑二：臨用前將試劑二B全部倒入試劑二A中，充分震蕩溶解，用不完的試劑2-8℃可保存4周。

3. 試劑三：臨用前加入3mL蒸餾水充分溶解，再將槍頭伸入液面下緩慢加入0.81mL濃硫酸，用不完的試劑2-8℃可保存4周。

4. 試劑四：臨用前加入13mL蒸餾水充分溶解，再加入20μL濃硫酸，用不完的試劑2-8℃可保存4周。

5. 工作液：臨用前根據(jù)測(cè)定數(shù)量將試劑三：試劑四=1mL：5mL（約60T，可根據(jù)樣本量按比例調(diào)整）的比例混勻，配制后于2-8℃可保存3天。

6. 標(biāo)準(zhǔn)品：10μmol/mL無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說(shuō)明：

植酸酶（Phytase）又叫肌醇六磷酸酶，是一種蛋白質(zhì)和糖的結(jié)合酶，植酸酶可以分解植酸產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷和肌醇，極大的提高生物對(duì)養(yǎng)分的利用率。土壤植酸酶主要來(lái)自于土壤中的微生物，在磷素循環(huán)中起著重要作用，土壤植酸酶在土壤改良和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展領(lǐng)域具有較強(qiáng)的應(yīng)用前景。

在一定的環(huán)境條件下，土壤植酸酶可以分解植酸鈉（肌醇六磷酸十二鈉）產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷和肌醇衍生物，在酸性條件下，無(wú)機(jī)磷和鉬酸銨顯色劑發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的鉬藍(lán)物質(zhì)，其在700nm有特征吸收峰，通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷的含量，可計(jì)算出土壤植酸酶的活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀/可見(jiàn)分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、研缽、30-50目篩、甲苯、濃硫酸、96孔板/微量玻璃比色皿、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

新鮮土樣自然風(fēng)干或 37℃烘箱風(fēng)干，過(guò) 30~50 目篩。

二、測(cè)定步驟

1、酶標(biāo)儀/可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至700nm?？梢?jiàn)分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋：將10μmol/mL無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋至1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125、0.039、0.02、0.01μmol/mL備用。

3、標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋可參考下表：

備注：實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需100µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4、在離心管中按下表步驟加樣：

     室溫靜置15min，于700nm處測(cè)定吸光值，分別記為A測(cè)定、A對(duì)照、A標(biāo)準(zhǔn)、A空白。分別計(jì)算 ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白（標(biāo)準(zhǔn)曲線和空白管只需做 1-2 次，每個(gè)測(cè)定管需設(shè)置一個(gè)對(duì)照管）。

三、土壤植酸酶活性的計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測(cè)定（y，ΔA測(cè)定）代入公式計(jì)算樣本濃度（x，μmol/mL）。

2. 土壤植酸酶活性計(jì)算

單位定義：37℃下每g土壤每天在反應(yīng)體系釋放1μmol無(wú)機(jī)磷為1個(gè)酶活力單位。

土壤植酸酶活性（U/g）= x×V反總÷W÷T=0.52x÷W

V反：反應(yīng)體系總體積，0.52mL；W：土壤質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，24h=1d。

注意事項(xiàng)：

1. 為防止沸水浴10min過(guò)程中水分散失，建議使用螺旋蓋的離心管或用封口膜給EP管纏口。

2. 如果ΔA測(cè)定< 0.01，適當(dāng)延長(zhǎng)第一步37℃反應(yīng)時(shí)間或加大樣本量后，重新測(cè)定。如果ΔA測(cè)定＞1.2，建議將上清液用蒸餾水適當(dāng)稀釋后進(jìn)行測(cè)定，注意乘以稀釋倍數(shù)。

3. 結(jié)果于30min內(nèi)測(cè)定完畢，盡量保證所有樣本測(cè)定時(shí)間的一致性。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1.   取0.03g三葉草土壤，按照測(cè)定步驟操作，在96孔板中測(cè)得A測(cè)定 = 0.359，A對(duì)照 = 0.28，?A測(cè)定= 0.079，將?A代入標(biāo)曲公式y = 1.1104x + 0.0077，得出x= 0.0642，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

土壤植酸酶活性（U/g）= 1.113 U/g。

2.   取0.03g蘑菇土土壤，按照測(cè)定步驟操作，在96孔板中測(cè)得A測(cè)定 = 0.442，A對(duì)照 = 0.32，?A測(cè)定= 0.122，將?A代入標(biāo)曲公式y = 1.1104x + 0.0077，得出x= 0.1029，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

土壤植酸酶活性（U/g）= 1.784 U/g。

參考文獻(xiàn)：

[1] Berry D F, Shang C, Zelazny L W. Measurement of phytase activity in soil using a chromophoric tethered phytic acid probe[J]. Soil Biology & Biochemistry, 2009, 41(2):192-200.

[2] Marshall, Arebojie, Azeke, et al. Effect of germination on the phytase activity, phytate and total phosphorus contents of rice (Oryza sativa), maize (Zea mays), millet (Panicum miliaceum), sorghum (Sorghum bicolor) and wheat (Triticum aestivum) [J]. Journal of Food Science & Technology, 2011, 48(6):724-729.

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