微生物及液體樣本中甲醛脫氫酶（FDH）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC4995

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前去1支加入0.25 mL蒸餾水，震蕩使其充分溶解（1瓶粉劑溶解后可做100T，為了延長使用時間，此產(chǎn)品多給1瓶粉劑），可分裝后-20℃保存2周，避免反復(fù)凍融。

2、 試劑二工工作液：臨用前按試劑二：蒸餾水=1:29的體積比例稀釋試劑二，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3、 試劑三：臨用前取1支加入0.6 mL蒸餾水，震蕩使其充分溶解。用不完的試劑2-8℃分裝保存2周。

產(chǎn)品說明：

甲醛脫氫酶存在于絕大多數(shù)原核生物以及所有的真核生物中，是一種將甲醛進(jìn)行轉(zhuǎn)換的氧化還原酶。甲醛脫氫酶催化甲醛和 NAD⁺產(chǎn)生 NADH，在 340nm 處的吸光值會增加，測定 340nm處的吸光值變化，可計算得到甲醛脫氫酶的活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔UV板、低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋/培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液槍、超聲波細(xì)胞破碎儀、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1 mL提取液，超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3s，間隔9s，總時間 3 min）；然后8000 g，4℃，離心10 min，取上清（若上清不夠澄清，建議重復(fù)上述離心步驟），置于冰上待測。

血清及液體樣本：直接檢測。

二、測定步驟

1、 紫外分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至340 nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2、 臨用前將試劑一置于37℃預(yù)熱10 min。

3、 在微量石英比色皿或96孔UV板中依次加入 20 μL 樣本、110 μL試劑一、50 μL試劑二工作液、10 μL試劑三、10 μL試劑四，充分混勻后于340nm處測定20s時的吸光值A1，迅速置于37℃水浴或培養(yǎng)箱5min（酶標(biāo)儀有控溫功能可將溫度調(diào)至37℃），拿出迅速擦干測定5min20s時的吸光值A2。計算ΔA=A2-A1。

三、酶活性計算

A、按微量石英比色皿計算

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞中FDH活力的計算

（1）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算：

單位的定義：每10⁴個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

FDH酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣÷V樣總×N）÷T×F =321.54×ΔA÷N×F

（2）按蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

FDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F

2、血清（漿）或液體樣本FDH活力的計算

（1）按液體體積計算：

單位的定義：每mL液體樣本中每分鐘催化1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

FDH酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣÷T×F =321.54×ΔA×F

（2）按蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化生成1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

FDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F

e：NADH 摩爾消光系數(shù)，6220 L/ mol/cm；d：石英比色皿光徑，1cm；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V反總：酶促反應(yīng)總體積，2×10^-4L；V樣總：加入提取液體積，1 mL；V樣：加入樣本體積，0.02 mL；T：反應(yīng)時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；N：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，以萬計；F：稀釋倍數(shù)；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹ nmol。

B、按96孔UV板計算

將上述公式中d=1cm變?yōu)?/span>d=0.6cm，代入公式進(jìn)行計算即可。

注意事項：

1、如果測定吸光值A＞1.5或ΔA＞0.5，建議稀釋樣本后再測定，計算公式中乘以稀釋倍數(shù)；如果測定吸光值較低，建議增加樣本量后再進(jìn)行測定。

2、試劑四有毒性，實驗時請佩戴口罩手套等防護(hù)措施。

實驗實例：

1、 取0.1g大腸桿菌沉淀加入1 mL提取液，超聲波破碎細(xì)胞（功率300W，超聲3s，間隔9s，總時間 3min）；然后8000 g，4℃，離心10 min，取上清按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA=A2-A1=0.2523-0.0396=0.2127，按細(xì)菌數(shù)量計算酶活得：

FDH酶活（U/10⁴ cell）= 321.54×ΔA÷N =683.9 U/g。

2、 取0.02 mL牛血清按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA =A2 -A1 =0.1101-0.0772=0.0329，按液體體積計算酶活得：

FDH酶活（U/mL）=321.54×ΔA=10.579 U/mL。

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