輔酶 II NADP(H)含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)（WST顯色法）

可見(jiàn)分光光度法

貨號(hào)：BC5200

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入12mL蒸餾水充分混勻，溶解后2-8℃保存4周。

2、 試劑四：臨用前將試劑四A溶解到試劑四B中，分裝保存，避免反復(fù)凍融，-20℃保存4周。

1、 NADP標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入 1.27 mL 蒸餾水，即 5 µmol/mL，-20℃可以保存2周。

2、 NADPH標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入 1.2 mL 蒸餾水，即 5 µmol/mL，-20℃可以保存2周。

產(chǎn)品說(shuō)明：

輔酶Ⅱ NADP(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NADP⁺和 NADPH 含量測(cè)定可以計(jì)算 NADP（NADPH + NADP⁺)含量和 NADPH/NADP+比值，其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)密切相關(guān)。NADPH/NADP⁺比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一，而且在 PPP 途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NADP⁺和NADPH。在1-mPMS作用下，WST-1可與NADPH反應(yīng)，產(chǎn)生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰，而NADP⁺可被6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為NADPH，進(jìn)一步采用WST-1檢測(cè)。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋，研缽/勻漿器、超聲破碎儀，可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、血清（漿）中NADP⁺和NADPH的提?。?/span>

NADP⁺的提取：取血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為1:5-10的比例，（建議取0.1mL血清（血漿），加入0.5 mL酸性提取液），煮沸5min(蓋緊，以防止水分散失)；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL堿性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清,冰上待測(cè)。

NADPH的提取：取血清（漿）體積（mL）：堿性提取液體積（mL）為1:5-10的比例，（建議取0.1mL血清（血漿），加入0.5 mL堿性提取液），煮沸5min(蓋緊，以防止水分散失)；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清,冰上待測(cè)。

2、組織中NADP⁺和NADPH的提取：

NADP⁺的提取：建議取0.1g組織質(zhì)量，加入0.5mL酸性提取液，冰浴研磨，煮沸5min(蓋緊，以防止水分散失)；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL堿性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清,冰上待測(cè)。

NADPH的提取：建議取0.1 g組織質(zhì)量，加入0.5 mL堿性提取液，冰浴研磨，煮沸5min(蓋緊，以防止水分散失)；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清,冰上待測(cè)。

3、細(xì)胞或細(xì)菌中NADP⁺和NADPH的提?。?/span>

NADP⁺的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，離心棄上清，建議500萬(wàn)細(xì)胞或者細(xì)菌加入0.5mL酸性提取液，超聲波破碎（冰浴，功率200W，超聲3s，停10s，重復(fù)30次），煮沸5min(蓋緊，以防止水分散失)，冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL堿性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清,冰上待測(cè)。

NADPH的提取：建議500萬(wàn)細(xì)胞或者細(xì)菌加入0.5mL堿性提取液，超聲波破碎（冰浴，功率200W，超聲3s，停10s，重復(fù)30次），煮沸 5min(蓋緊，以防止水分散失)；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清,冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 NADP⁺標(biāo)準(zhǔn)品：用蒸餾水稀釋為2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.01、0nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液（0nmol/mL即空白管）。

3、 NADPH標(biāo)準(zhǔn)品：用蒸餾水稀釋為2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液（0nmol/mL即空白管）。

4、 稀釋表（附于說(shuō)明書(shū)最后）

5、 在EP管中按順序加入下列試劑：

混勻，450nm下比色，讀取吸光值，NADP⁺的記為：ΔA _NADP+= A₂- A₁，NADPH的記為ΔA_NADPH= A₂’- A₁’，NADP標(biāo)準(zhǔn)管的記為ΔA _{NADP標(biāo)}= A_標(biāo)-A_空白管。NADPH標(biāo)準(zhǔn)管的記為ΔA _{NADPH標(biāo)}= A_標(biāo)’-A_空白管。（標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)只需做1-2次，每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管）。

三、NADP⁺和NADPH含量計(jì)算

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：

（1） NADP⁺標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x₁，nmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y₁，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將ΔA測(cè)定代入方程得到x₁（nmol/mL）。

（2） NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x₂，nmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y₂，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將ΔA′代入方程得到x₂（nmol/mL）。

2、NADP⁺和NADPH含量計(jì)算

（一）NADP⁺含量計(jì)算

（1） 按液體體積計(jì)算：NADP⁺含量(nmol/mL）= x₁×（V提取+V血清）÷V血清=11×x₁

（2） 按樣本蛋白濃度計(jì)算 NADP⁺ (nmol/mg prot）= x₁×V提取÷(V提取×Cpr)= x₁ ÷ Cpr

（3） 按樣本鮮重計(jì)算NADP⁺含量(nmol/g 質(zhì)量）= x₁×V提取÷W= x₁÷W 

（4） 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：NADP⁺含量(nmol/10⁴ cell）= x₁×V提取÷500=0.002×x₁

（二）NADPH含量計(jì)算

（1） 按液體體積計(jì)算：NADPH含量(nmol/mL）= x₂×（V提取+V血清）÷V血清=11×x₂

（2） 按樣本蛋白濃度計(jì)算 NADPH (nmol/mg prot）= x₂×V提取÷(V提取×Cpr)= x₂ ÷ Cpr

（3） 按樣本鮮重計(jì)算NADPH含量(nmol/g 質(zhì)量）= x₂×V提取÷W= x₂÷W 

（4） 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：NADPH含量(nmol/10⁴ cell）= x₂×V提取÷500=0.002×x₂

V提取：加入提取液體積，1mL；V血清：血清（漿）體積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣

本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

注意事項(xiàng)：

1、如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三按比例配成混合液。

2、反應(yīng)過(guò)程中注意避光。

3、由于每一個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管，本試劑盒50管可以測(cè)定24個(gè)NADP⁺或NADPH。

4、如果測(cè)定吸光值超過(guò)線(xiàn)性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進(jìn)行測(cè)定。同步修改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. NADP⁺的測(cè)定：稱(chēng)取 0.1g冬青葉片，按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作，玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.052-0.036=0.016，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y₁=0.333x-0.0063,根據(jù)標(biāo)曲得出x₁=0.067，NADP⁺含量得：

NADP⁺ (nmol/g 質(zhì)量）= x₁÷W=0.67 nmol/g 質(zhì)量。

NADPH的測(cè)定：稱(chēng)取 0.1g 冬青葉片，按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作，玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.153-0.096=0.057，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y₂=0.0914x-0.0065,根據(jù)標(biāo)曲得出x₂=0.695，NADPH含量得：NADPH (nmol/g 質(zhì)量）= x₂÷W=6.947 nmol/g 質(zhì)量。

2. NADP⁺的測(cè)定：稱(chēng)取 0.1g 小鼠肝臟，按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作，玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.042-0.028=0.014，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y₁=0.333x-0.0063,根據(jù)標(biāo)曲得出x₁=0.061，NADP⁺含量得：NADP⁺ (nmol/g 質(zhì)量）= x₁÷W=0.61nmol/g 質(zhì)量。

NADPH的測(cè)定：稱(chēng)取 0.1g 小鼠肝臟，按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作，玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.19-0.063=0.127，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y₂=0.0914x-0.0065,根據(jù)標(biāo)曲得出x₂=1.461，NADPH含量得：NADPH (nmol/g 質(zhì)量）= x₂÷W=14.61 nmol/g 質(zhì)量。

3. NADP⁺的測(cè)定：取0.1mL牛血清，按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作，玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.048-0.030=0.018，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y₁=0.333x-0.0063,根據(jù)標(biāo)曲得出x₁=0.073，NADP⁺含量得：

NADP⁺ (nmol/mL）= 11×x₁=0.803 nmol/mL。

NADPH的測(cè)定：取0.1mL牛血清，按提取步驟提取后按照測(cè)定步驟操作，玻璃比色皿測(cè)得吸光值后計(jì)算 ΔA 測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.056-0.032=0.024，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y₂=0.0914x-0.0065,根據(jù)標(biāo)曲得出x₂=0.334，NADPH含量得：NADPH (nmol/mL）= 11×x₂=3.671 nmol/mL。

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