*（H₂O₂）含量檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC3595
規(guī)格：100T/96S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：*自備。

2. 試劑二：臨用前加入3 mL濃鹽酸充分溶解備用，用不完的試劑2-8℃保存。

3. 標準品：1 mmol/mL H₂O₂標準液。

產品說明：
H₂O₂是生物體內最常見的活性氧分子，主要由SOD和XOD等催化產生，由CAT和POD等催化降解。H₂O₂不僅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互轉化的樞紐。一方面，H₂O₂可以直接或間接地氧化細胞內核酸，蛋白質等生物大分子，并使細胞膜遭受損害，從而加速細胞的衰老和解體；另一方面H₂O₂也是許多氧化應激反應中的關鍵調節(jié)因子。
H₂O₂與硫酸鈦生成黃色的過氧化鈦復合物，在415nm有特征吸收。
技術指標：
低檢出限：0.0027 μmol/mL
線性范圍：0.0195-3 μmol/mL
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、*、濃鹽酸、研缽/勻漿器和冰。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
細菌或細胞樣本的制備：收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照每500萬細菌或細胞加入1mL試劑一，超聲波破碎細菌或細胞（功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織樣本的制備：稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一進行冰浴勻漿；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
血清（漿）樣本：按照每100μL血清（漿）加入0.9mL試劑一的比例充分混勻；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
二、測定步驟

1. 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至415nm，蒸餾水調零。

2. 將試劑二、三和四37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

3. 如果用96孔板將則用*將1mmol/mL標準液稀釋為2μmol/mL的標準溶液，用微量玻璃比色皿則用*將1mmol/mL標準液稀釋為1μmol/mL的標準溶液。

4. 在EP管中按順序加入下列試劑

加入試劑四，充分震蕩溶解沉淀后，室溫靜置5min，取200μL轉移至微量玻璃比色皿或96孔板中測定415nm處吸光值（空白管只要做1-2次即可）。計算?A測定=A測定管-A空白管，?A標準=A標準管-A空白管。
三、H₂O₂含量計算
A、按96孔板計算
1、按照細菌、細胞數量計算：
H₂O₂含量（μmol/10⁴ cell）=?A測定÷(?A標準÷C標液)×V樣本÷(500×V樣本÷V提取)=0.004×?A測定÷?A標準
2、按組織質量計算：
H₂O₂含量（μmol/g 質量）=?A測定÷（?A標準÷C標液）×V樣本÷(V樣本÷V提取×W)=2×?A測定÷?A標準÷W
3、按照蛋白濃度計算：
H₂O₂含量（μmol/mg prot）=?A測定÷（?A標準÷C標液）×V樣本÷（Cpr×V樣本）=2×?A測定÷?A標準÷Cpr
4、按血清（漿）體積計算：
H₂O₂含量(μmol/mL)=?A測定÷（?A標準÷C標液）×10=20×?A測定÷?A標準
500：細胞或細菌總數，萬個；C標液：H₂O₂標準溶液濃度，2μmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.25mL；W：組織質量，g；V提?。禾崛∵^程中所用體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；10：血清稀釋倍數，[0.1mL血清（漿）+0.9mL試劑一] ÷0.1mL血清（漿）=10。
B、按微量玻璃比色皿計算
將公式中的C標液-2μmol/mL改為C標液-1μmol/mL進行計算即可。
注意事項：

1. 由于試劑一易揮發(fā)，試劑一必須先預冷再加，研磨時必須在冰上研磨。

1. 本試劑盒中試劑的揮發(fā)性較高，請帶一次性手套和口罩。

2. 如果樣本吸光值大于1.1，建議將樣本用試劑一稀釋后進行測定。

3. 試劑一會使蛋白變性，若按蛋白濃度計算需要另提組織重新測定蛋白濃度

實驗實例：

1. 取0.1g心臟，加入1mL試劑一進行冰浴勻漿；8000g 4℃離心10min，取全部上清液（注意吸取干凈），置冰上，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算?A測定=A測定管-A空白管=0.083-0.046=0.039，?A標準=A標準管-A空白管=0.824-0.046=0.778，按樣本質量計算含量得：

H₂O₂含量（μmol/g質量）=2×?A測定÷?A標準÷W=1 μmol/g質量。

1. 取0.1g茶葉，加入1mL試劑一進行冰浴勻漿；8000g 4℃離心10min，取全部上清液（注意吸取干凈），置冰上，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算?A測定=A測定管-A空白管=0.221-0.046=0.175，?A標準=A標準管-A空白管=0.824-0.046=0.778，按樣本質量計算含量得：

H₂O₂含量（μmol/g質量）=2×?A測定÷?A標準÷W=4.5 μmol/g質量。
相關發(fā)表文獻：

1. Yanan Wang,Chengzhen Liang,Zhigang Meng,et al. Leveraging Atriplex hortensis choline monooxygenase to improve chilling tolerance in cotton. Environmental and Experimental Botany. June 2019;162:364-373.(IF3.712)

2. Xuechan Tang,Xiaoli Xie,Xin Wang,et al. The Combination of piR-823 and Eukaryotic Initiation Factor 3 B (EIF3B) Activates Hepatic Stellate Cells via Upregulating TGF-β1 in Liver Fibrogenesis. International Medical Journal of Experimental. December 2018;(IF1.420)

3. Ying Zhao,Wengang Yu,Xiangyu Hu,et al. Physiological and transcriptomic analysis revealed the involvement of crucial factors in heat stress response of Rhododendron hainanense. Gene. June 2018;(IF2.638)

4. Lifang Lv,Tianyu Li,Xuelian Li,et al. The lncRNA Plscr4 Controls Cardiac Hypertrophy by Regulating miR-214. Molecular Therapy Nucleic Acids. March 2018;(IF5.919)

5. Moxian Chen,Fuyuan Zhu,Fengzhu Wang,et al. Alternative splicing and translation play important roles in hypoxic germination in rice. Journal of Experimental Botany. January 2019;(IF5.36)

6. Bingbing Cai,Qiang Li,Fengjiao Liu,et al. Decreasing fructose 1,6-bisphosphate aldolase activity reduces plant growth and tolerance to chilling stress in tomato seedlings. Physiologia Plantarum. December 2017;(IF3)

7.  Xiaorong Guo,Junfeng Niu,Xiaoyan Cao. Heterologous Expression of Salvia miltiorrhiza MicroRNA408 Enhances Tolerance to Salt Stress in Nicotiana benthamiana. International Journal of Molecular Sciences. December 2018;(IF4.183)

參考文獻：
[1] Satterfield C N, Bonnell A H. Interferences in titanium sulfate method for hydrogen peroxide[J]. Analytical Chemistry, 1955, 27(7): 1174-1175.
[2] Amin V M, Olson N F. Spectrophotometric determination of hydrogen peroxide in milk[J]. Journal of Dairy Science, 1967, 50(4): 461-464

[3] Sima Y H, Yao J M, Hou Y S, et al. Variations of hydrogen peroxide and catalase expression in Bombyx eggs during diapause initiation and termination[J]. Archives of insect biochemistry and physiology, 2011, 77(2): 72-80.
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